作者:Chinta sidharthani博士，Lily Ramsey, llm2024年9月18日
使用修饰过的核苷酸，如N1-methylpseudouridine (N1Mψ)在信使核糖中核酸(mRNA)疫苗有助于减轻全身炎症反应提高疫苗的效力。然而，半衰期短和不良反应等因素影响mRNA疫苗的疗效。
在最近发表在《自然生物技术》杂志上的一项研究中，波士顿大学的科学家们研究了在自我扩增的RNA中使用修饰的核苷酸是否可以解决mRNA疫苗的缺点，并有效地预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)。
研究:用修饰的核苷酸在自我扩增的RNA中完全取代可抑制干扰素反应鼻塞和增加效力。图片来源:KomootP/Shutterstock.com
背景
化学修饰的核苷酸已用于mRNA疫苗，以提高其进入细胞的能力，使mRNA分子更稳定，并降低炎症免疫反应。修饰的核苷酸被广泛用于开发针对2019冠状病毒病(COVID-19)的mRNA疫苗。
与正常RNA相比，在mRNA疫苗中使用N1mΨ可防止toll样受体和其他免疫传感器的激活，并提高疫苗的有效性。然而，mRNA疫苗的半衰期较短，因此需要更大、更频繁的剂量，从而增加了不良反应的风险。
自我扩增RNA或saRNA可以在体内复制，小剂量产生大量蛋白质，使其成为疫苗中mRNA的理想替代品。然而，saRNA会引发早期免疫反应，从而降低saRNA疫苗的效力。
尽管在sarna中使用化学修饰的核苷酸可能是一种潜在的解决方案，但该方法尚未有效。
一个关于研究
在本研究中，研究人员探索了在saRNA构建体中使用各种修饰的核苷酸来改善蛋白质表达和转染效率，增强基因治疗和疫苗的疗效。
合成了一个saRNA构建文库，通过体外转录取代了修饰的核苷酸5-甲基尿嘧啶(m5U)、5-甲基胞苷(m5C)和5-羟甲基胞苷(hm5C)。报告蛋白也被编码到saRNA中。
然后，研究人员将hm5C和m5C修饰的saRNA与未修饰的saRNA和N1mΨ-modified mRNA的效率进行了比较。将修饰后的saRNA构建物导入人胚胎肾细胞系HEK293T。
阳离子脂质转染，其中带正电的脂质与saRNA络合以促进进入，用于将构建物转染到细胞中并评估转染效果。
此外，sarna也被装载到脂质纳米颗粒中，并转染到多种细胞类型，包括永生化的人T淋巴细胞Jurkat细胞和小鼠成肌细胞C2C12细胞。
体外转录后，采用纤维素层析纯化RNA制剂，去除双链RNA杂质，降低不良免疫反应。
通过用装载saRNA构建物的脂质纳米颗粒培养外周血单核细胞，测量修饰和未修饰的saRNA对免疫系统的影响。
免疫应答通过分析细胞因子和干扰素相关基因的表达，特别是干扰素α和干扰素β的表达来评估。此外，使用小鼠模型进行了体内实验，其中脂质纳米颗粒包裹的sarna通过肌肉注射给小鼠。
saRNA结构是用萤火虫荧光素酶基因编码的，这使得使用生物发光成像可以暂时监测蛋白质的表达。此外，定期分析小鼠的血清样本以测量干扰素水平并评估全身免疫反应。
通过将SARS-CoV-2刺突蛋白基因编码到saRNA构建体中，还测试了对saRNA疫苗的剂量反应。使用不同剂量的saRNA疫苗的小鼠受到致命的SARS-CoV-2变体的攻击，并通过测量血液中中和抗体的水平来测试疫苗的功效。
主要发现
研究发现，含有hm5C和m5C的修饰saRNA的转染效率明显高于标准的、未修饰的saRNA构建物。在HEK293T细胞中，含有m5C的saRNA的蛋白表达水平比未修饰的saRNA高4.9倍，比N1mΨ-modified mRNA的蛋白表达高68倍。
转染后m5c修饰的saRNA表达稳定且持续一周。m5c修饰的saRNA在三种细胞系中的蛋白表达均明显优于未修饰的saRNA和N1mΨ-modified mRNA。
体内实验还表明，与未修饰的saRNA相比，m5c修饰的saRNA在28天内蛋白表达稳定，炎症免疫反应降低。
m5c修饰的SARS-CoV-2 saRNA疫苗即使在低剂量下也能产生更好的存活率，与未修饰的saRNA和N1mΨ-modified mRNA相比，其诱导的中和抗体滴度显着更高。
结论
总体而言，研究发现在saRNA构建体中使用化学修饰的核苷酸m5C显著提高了转染效率和蛋白表达。此外，使用m5c修饰的saRNA编码SARS-CoV-2刺突蛋白作为疫苗，比未修饰的saRNA具有更高的存活率和更低的炎症反应。
这些发现强调了m5c修饰的saRNA在开发低剂量疫苗方面的潜在应用，这些疫苗具有长效和减少不良反应的潜力。
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